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熒光定量PCR可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析

更新時(shí)間:2025-04-09      點(diǎn)擊次數(shù):161
  熒光定量PCR(qPCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,它將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
 
  熒光定量PCR的測(cè)定步驟:
 
  1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:
 
  -儀器檢查:打開(kāi)設(shè)備電源,檢查是否正常啟動(dòng);查看觸摸屏、電腦連接等是否正常。
 
  -樣品準(zhǔn)備:確保樣品的質(zhì)量良好,無(wú)雜質(zhì)和污染,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)稀釋樣品。
 
  -引物設(shè)計(jì):合理設(shè)計(jì)引物序列,確保其特異性和互補(bǔ)性,避免引物間的二聚體或非特異性擴(kuò)增。
 
  -反應(yīng)體系準(zhǔn)備:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備好反應(yīng)體系,包括引物、模板DNA、熒光標(biāo)記的探針和PCR反應(yīng)緩沖液等。
 
  2.設(shè)置PCR反應(yīng):
 
  -選擇適當(dāng)?shù)臒嵫h(huán)參數(shù):包括初始變性溫度和時(shí)間、退火溫度和時(shí)間以及延伸溫度和時(shí)間。這些參數(shù)應(yīng)根據(jù)具體的引物和模板特性進(jìn)行優(yōu)化。
 
  -將反應(yīng)體系加入PCR管或板中:并確保密封良好以避免污染和蒸發(fā)。
 
  -將PCR管或板放入PCR儀中:并關(guān)閉蓋子以確保溫度均勻分布。
 
  3.開(kāi)始PCR反應(yīng):
 
  -啟動(dòng)PCR程序:按照設(shè)定的熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
 
  -實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào):在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)強(qiáng)度。
 
  4.數(shù)據(jù)分析:
 
  -生成擴(kuò)增曲線(xiàn):通過(guò)將熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)作圖生成擴(kuò)增曲線(xiàn)。
 
  -確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct值):Ct值是指擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。
 
  -計(jì)算相對(duì)表達(dá)量或絕對(duì)拷貝數(shù):使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法或比較\(2^{-\Delta\Delta Ct}\)法等方法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析。
熒光定量PCR
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